ارزیابی قابلیت اتصال ناحیه غنی از سیستئین در انتهای آمینوی متالوتیونین تیپ 1 برنج ((osmti-1b به فلز کادمیوم از طریق حذف ناحیه غنی از سیستئین انتهای کربوکسی

متالوتیونین ها (mt) گروهی از پروتئین های غنی از آمینواسیدهای سیستئین و با وزن مولکولی کم (5 تا 10 کیلودالتون) هستندکه می توانند از طریق گروه تیول آمینواسیدهای سیستئن به فلزات متصل شوند. بیشتر مطالعات بر روی mt ها در گیاهان به بررسی بیان این ژن ها در بافت های مختلف محدود شده است و تحقیقات اندکی تاکنون بر روی نقش و ساختار mt ها صورت گرفته است. تحقیق حاضر با هدف حذف انتهای کربوکسی از ایزوفرم osmti-1b متعلق به تیپ یک mt برنج و تولید فرم موتاسیون یافته n-osmti-1b و بررسی نقش آن در ایجاد تحمل به تنش فلزات کادمیوم و نیکل در مقایسه با فرم طبیعی آن (osmti-1b) انجام شد. به منظور تولید قطعه ژنیn-osmti-1b از ژن osmti-1b پرایمراختصاصی طراحی و ژن مورد نظر توسط pcr تکثیر و در ناقل بیانی pet41a همسانه سازی گردید. پس از تائید صحت همسانه سازی با استفاده از توالی یابی، دستواره تولید شده به میزبان بیانی e. coli سویه ی rosetta(de3) منتقل شد. با القاء بیان پروتئین توسط iptg، میزان قابل توجهی از پروتئین gst-n-osmti-1b تولید شد. تحمل سویه های بیان کننده ی پروتئین های gst-osmti-1b و gst-n-osmti-1b به فلزات سنگین از طریق ترسیم منحنی رشد باکتری ها در حضور نمک های cdcl2 و nicl2 و هم چنین اندازه گیری میزان کاهش فلز از محیط کشت با استفاده از دستگاه طیف سنجی جذب اتمی (aas) بررسی شد. با خالص سازی پروتئین نوترکیب، امکان بررسی تمایل و ظرفیت اتصال آن به فلزات کادمیوم و نیکل در مقایسه با فرم طبیعی gst-osmti-1b فراهم گردید. به این منظور از روش های مختلف شامل بررسی تغییر در الگوی جذب نور و همچنین واکنش با معرف اِلمن استفاده گردید. نتایج حاصل از بررسی منحنی رشد سویه ی موتاسیون یافته به فلزات نشان داد که بیان پروتئین gst-n-osmti-1b موجب افزایش تحمل سلول های باکتری به فلزات کادمیوم و نیکل می شود. اندازه گیری میزان فلز کاهش یافته از محیط کشت توسط طیف سنجی جذب اتمی نشان داد سویه ی موتاسیون یافته قادر است 4/7 % از فلز کادمیوم و 63/3 % نیکل را از محیط کشت جذب کند که این میزان برای سویه بیان کننده پروتئین کامل gst-osmti-1b برای کادمیوم 71/11 % و برای نیکل 22/8% بود. مقایسه مقدار فلز جذب شده در این دو سویه نشان داد که این میزان در سویه بیان کننده پروتئین gst-n-osmti-1b به دلیل حذف انتهای کربوکسی که موجب کاهش ظرفیت جذب فلز می شود، کمتر می باشد. برای بررسی قابلیت اتصال پروتئین gst-n-osmti-1b به کادمیوم و نیکل در شرایط درون سلولی از واکنش پروتئین های موتاسیون یافته تولید شده در محیط حاوی فلز و بدون فلز با معرف المن استفاده شد. نتایج نشان داد که سرعت اولیه واکنش معرف المن با پروتئین در فرم بدون فلز بیشتر از پروتئین های حاوی کادمیوم و نیکل بود که این موضوع بیانگر جذب این دو فلز توسط پروتئین می باشد ولی نسبت به پروتئین gst-osmti-1b این واکنش از سرعت کمتری برخوردار است که علت آن کمتر بودن گروه های تیول آزاد آن می باشد. برای بررسی واکنش المن با پروتئین هایی که به صورت مستقیم در معرض فلز قرار گرفته بودند، ابتدا فرم عاری از فلز (آپو پروتئین) آنها با استفاده از روش اسیدی کردن تولید و سپس در معرض فلزات کادمیوم و نیکل قرار گرفتند که نتایج بدست آمده در شرایط درون سلولی را تائید کردند. همچنین بررسی تغییر در الگوی جذب نور پروتئین موتاسیون یافته نتایج جذب کادمیوم و نیکل را توسط این پروتئین تائید کرد. به طور کلی نتایج بدست آمده، فعالیت پروتئین موتاسیون یافته را در جذب فلز حتی بدون انتهایی کربوکسی تأیید می کند که این موضوع بیانگر قابلیت اتصال انتهای آمینو به طور مستقل از انتهای کربوکسی به فلز می باشد.